Optical Imaging (OI)

Molekulare Bildgebung durch Detektion von Licht

Methode

Optical Imaging (OI) ist eine Anwendung der molekularen Bildgebung. Sie basiert auf der Detektion von Licht, das von vitalen Zellen oder Gewebe emittiert wird. Die zwei meist genutzten Applikationen verwenden als Signalquelle Fluoreszenz (Fluorescence Imaging: FLI) oder Biolumineszenz (Bioluminescence Imaging: BLI). Detektiert wird das emittierte Licht durch eine sensitive, signalverstärkende cooled charge-coupled device (CCD) Kamera.

Vorteile von OI gegenüber anderen bildgebenden Verfahren:

  • relativ geringe Kosten
  • große Sensitivität bezüglich der Signaldetektion
  • geringe Messdauer (Sekunden bis Minuten)
  • Mit OI lassen sich longitudinale Studien am selben Objekt oder Tier realisieren.

Nachteile dieser Methode:
Während der Passage durch diverse Gewebetypen wird das emittierte Licht absorbiert und gestreut. Daher sind die Beurteilung der exakten räumlichen Lokalisation und die Quantifizierung der Signalintensität beeinträchtigt. Und: Das durch die Kamera detektierte Bild entspricht nur einer 2-dimensionalen Oberflächenabbildung.

Für BLI muss ein Reporter-Gen in die Zielzellen oder das Gewebe eingebracht werden, das die genetische Information für ein lichtgenerierendes Enzym (Luciferase) enthält.
Für FLI werden fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe verwendet, die durch eine externe Lichtquelle angeregt werden müssen. Die meist genutzten fluoreszierenden Proteine sind GFP (green fluorescent protein) und RFP (red fluorescent protein). Der Vorteil dieser Proteine ist, dass das Signal substratunabhängig ist. Der Nachteil von FLI sind signifikante Hintergrundsignale, erzeugt durch Autofluoreszenz endogener Moleküle, wie etwa Hämoglobin oder Cytochrome.

 

Fluoreszenz-Detektion von RFP (links) und GFP (rechts): Gli36dEGFR-Zellen wurden in Zellkultur mit einem Virus infiziert, der die Expression von GFP (permanent) und die von RFP (reguliert) ermöglicht. Die Expression von RFP wurde bei einem Teil der Zellen mit Hilfe der Substanz Doxycyclin induziert. Anschließend wurden induzierte und nicht-induzierte Zellen subkutan implantiert. Beide Zellvarianten sind durch die permanente GFP-Expression nachzuweisen. RFP-exprimierende Zellen, im Bild unten sichtbar, sind dagegen nur im induzierten Zustand zu sehen (Kodak Image Station 2000).

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Aufnahmesysteme

Signalverstärkende Detektoren benutzen Photokathoden, um aufgefangene Photonen in Elektronen umzuwandeln, zu vervielfachen und mittels eines Phosphorscreens wieder in Photonen zu konvertieren. Anschließend werden die Lichtquanten durch den CCD-Chip detektiert. Abhängig vom Typ der Photokathode lässt sich Licht verschiedener Wellenlängen detektieren:

Bialkali-Photokathoden detektieren am besten Licht des Blau-Grünen Spektrums und sind weniger sensitiv im Wellenlängenbereich über 600 nm. Gallium-Arsenide-Photokathoden nehmen auch Licht aus dem roten Spektralbereich war.
Das thermische Rauschen lässt sich reduzieren: CCD-Kameras werden bis zu -120°C gekühlt. Dadurch verbessert sich das Verhältnis von Signal zu Hintergrund deutlich, ohne Einfluss auf die spektrale Sensitivität.

 

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Luziferasen

Luziferasen sind Enzyme, die sichtbares Licht erzeugen durch die Oxidation von enzymspezifischen Substraten in Anwesenheit von Sauerstoff (und manchmal anderer Co-Faktoren wie zum Beispiel ATP). Diese Enzyme kommen in manchen Bakterien vor, in marinen Krustentieren, Fischen und Insekten. Da das Gewebe von Säugern kein Licht emittiert, ist ein klarer Vorteil von In-vivo-BLI das sehr geringe Hintergrundsignal.

Die meist genutzten Luziferasen stammen vom nordamerikanischen Glühwürmchen (Photinus pyralis) und von der Seequalle (Renilla reniformis). Die Luziferase von Photinus pyralis setzt ihr Substrat, D-Luciferin, in Oxyluciferin um und emittiert grünes Licht mit einer Wellenlänge von 562 nm. Renilla Luziferase hingegen benutzt das Substrat Coelenterazin, um blaues Licht von 482 nm zu produzieren.

 

Technische Ausstattung

Durch eine Industriekooperation können wir zurzeit eine Berthold Nightowl Kamera nutzen. Eine Zusammenarbeit mit dem ZMMK (Zentrum für Molekulare Medizin) an der Universität zu Köln erlaubt uns Zugang zu einem Xenogen IVIS 200 System.

 

 

Biolumineszenz-Aufnahme von Luziferase-exprimierenden Zellen. Zellen mit regulierter Expression von Luziferase zeigen nur in Gegenwart der Induktorsubstanz Doxycyclin (Dox) Luziferase-Aktivität (oben -Dox, unten +Dox; Xenogen, IVIS 200).

Biolumineszenz-Aufnahme eines wachsenden Tumors. Nachweis des Wachstums eines Luziferase-exprimierenden Tumors mittels Biolumineszenz nach Injektion des Substrates D-Luciferin.